技術(shù)參數(shù)
產(chǎn)品描述
摘要
本產(chǎn)品用于定性檢測膀胱癌患者福爾馬林固定石蠟包埋樣本RNA中人類FGFR3基因上的6個(gè)熱點(diǎn)突變;運(yùn)用熒光PCR技術(shù)，當(dāng)天得到檢測報(bào)告，滿足臨床及時(shí)診治需求，輔助臨床實(shí)現(xiàn)腫瘤的個(gè)體化治療。
檢測原理
本試劑盒檢測原理是基于擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng)(amplification refractory mutation system，ARMS)結(jié)合熒光定量PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)石蠟包埋樣本中提取的RNA進(jìn)行定性檢測。ARMS-PCR基本原理是，Taq DNA聚合酶缺少3′-5′外切酶活性，如果引物的3′端堿基與模板堿基不互補(bǔ)，則Taq DNA聚合酶無法延伸。本試劑盒根據(jù)已知突變?cè)O(shè)計(jì)特異的突變模板互補(bǔ)引物，使3′端堿基與突變模板堿基完全互補(bǔ)，與野生型模板不互補(bǔ)，同時(shí)在引物3′端的第2-5個(gè)堿基引入另外一個(gè)或者兩個(gè)錯(cuò)配堿基，使之與野生型模板之間形成多個(gè)錯(cuò)配以阻止野生型模板的延伸，實(shí)現(xiàn)FGFR3突變基因的檢測。
本試劑盒中的2個(gè)融合位點(diǎn)的檢測原理是在融合的兩個(gè)基因的外顯子上分別設(shè)計(jì)特異性引物和taqman探針，結(jié)合熒光定量PCR技術(shù)對(duì)石蠟包埋樣本中提取的RNA進(jìn)行定性檢測。
本試劑盒共采用了FAM、CY5和VIC三種熒光標(biāo)記的探針，檢測點(diǎn)突變的探針采用FAM熒光標(biāo)記，融合位點(diǎn)的探針采用CY5熒光標(biāo)記，內(nèi)控采用VIC標(biāo)記的熒光探針，內(nèi)控試劑監(jiān)控樣本RNA提取質(zhì)量和逆轉(zhuǎn)錄等過程。本試劑盒中同時(shí)含有UNG酶，可以選擇性降解含有dU的PCR產(chǎn)物，有效降低因PCR產(chǎn)物污染導(dǎo)致的假陽性。每個(gè)樣本共需要6個(gè)反應(yīng)孔，每個(gè)反應(yīng)孔只需要加入少量提取的樣本RNA，通過內(nèi)控的CT值來判斷樣本的質(zhì)量，樣本反應(yīng)孔的CT值來判斷樣本的陰陽性。
檢驗(yàn)方法
1. 提取膀胱癌患者福爾馬林固定石蠟包埋樣本RNA。
2. 按照說明書準(zhǔn)備逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。
3. 在相應(yīng)的八連管位置加入提取的RNA、陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品。
4. 進(jìn)行qPCR儀上機(jī)實(shí)驗(yàn)。
5. 根據(jù)內(nèi)控CT值和樣本CT值判讀結(jié)果。
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